人乳牙牙髓干细胞在干细胞治疗中的应用

干细胞治疗的理念是利用干细胞替代、修复和加强受损的组织与器官的生物学功能, 达到组织再生或修复的目的。获得合适的干细胞来源是干细胞治疗的重要部分。Miura等[1]于2003年从脱落乳牙的牙髓中分离培养出人乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED）, 具有自我更新和高度增殖, 表达间充质干细胞的表面标志物, 多向分化等间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）的典型生物学特征。目前, 学者们认为, SHED具有多种优势, 在干细胞治疗领域有广阔的应用前景。

1、 SHED的生物学特点和优势

SHED的胚胎发育起源于神经嵴外胚层, 这些组织迁徙到颌面部后形成外胚间充质[2]。与中胚层来源的MSC不同, SHED具有外胚层组织如神经组织的分化优势。除了MSC的典型标志物, 如CD146、CD90、CD105、CD73等之外[1, 3, 4], SHED还表达巢蛋白（nestin）、β 微管蛋白三（β Ⅲ -tubulin）、谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase, GAD）、神经元核抗原（neuronal nuclei, NeuN）等多种神经元表面标志物[1]及胚胎干细胞表面标志物, 如八聚体结合转录因子4（transcription factor Octamer-4, Oct4）、 Nanog、胚胎阶段特异性抗原（stage-specific embryonic antigen, SSEA）-3、SSEA-4、肿瘤识别抗原（tumor recognition antigen, TRA）-1-60和TRA-1-81[5]。可见其细胞特性的多样性及复杂性, 也预示其在多个领域有应用的潜能。

作为成体干细胞的一类, SHED具有普遍优点[6]：SHED取自将自然替换的乳牙牙髓, 来源易得且无创; 比胚胎干细胞和诱导多能干细胞所受伦理争议较少; 用于自体移植时, 可有效避免免疫排斥反应和免疫抑制剂的使用; 移植后致瘤风险较低。由此可见, 建立SHED库方便、安全、可行[7]。

SHED和其他MSC有很多相似之处。SHED的成骨分化潜能与骨髓间充质干细胞（bone marrow me-senchymal stem cell, BMMSC）类似[1, 8]。SHED与诞生牙、阻生第三磨牙来源的牙髓干细胞（dental pulp stem cell, DPSC）的形态、细胞表面标志物及多向分化潜能相似[9]。SHED又具有独特优势, 具有高度的增殖活性, 较DPSC和BMMSC具有更高的增殖活性和群体倍增数[1, 10], 较BMMSC具有更高的端粒酶活性[8]。SHED在免疫调节上具有优势。将SHED、BMMSC分别与外周血单核细胞共培养, 可以发现, SHED减少白细胞介素-17T辅助细胞（interleukin-17 T helper cell, Th17）的数量、降低白细胞介素（in-terleukin, IL）-17水平的能力更强; 给系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）小鼠静脉注射SHED和BMMSC, 可以发现SHED能更大程度减少外周血中Th17细胞的数量和增加调节性T细胞（T regulatory cell, Treg）/Th17细胞的比例[8]。SHED的成神经分化能力较强, 体内研究[11]表明, SHED在神经系统的定植存活和少突胶质细胞的定向分化潜能方面优势显著; 体外研究[12]显示, SHED比DPSC表达更多的神经元标志物, 具有更强的神经样细胞分化能力。

SHED展示出较好的生物学稳定性和良性特征, 相比于脐带MSC和月经血干细胞, SHED具有较低的凋亡性和衰老性, 在第10代仍可保持其梭形细胞形态[13]。

2、 SHED在干细胞治疗中的功能作用

2.1 干细胞多向分化潜能

SHED具备多向分化潜能, 在合适的条件下可定向分化, 发挥特定细胞的功能, 形成新生组织。

除了分化为经典的牙本质细胞、成骨细胞、血管内皮细胞等, SHED还具有跨系、跨胚层分化能力。Miura等[1]发现, SHED具有成神经分化潜能。SHED诱导分化形成神经球后, 经进一步诱导可形成多巴胺能神经元[14]。SHED还可向内胚层来源的肝细胞[15]、胰岛素样细胞[16]分化。

近年来, 对干细胞定向分化机制的研究越趋微观和精准。干细胞的定向分化需要特定细胞因子的诱导, 如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）与其受体1结合后作用于信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases, ERK）和蛋白激酶BAKT信号通路, 可介导SHED分化为血管内皮细胞从而形成新生血管[17]。细胞定向分化的启动与特定的信号通路有关, 如Wnt/β -catenin信号通路是调节SHED和DPSC成血管分化的开关, 其激活则启动血管分化过程, 抑制则反之[18]。

2.2 细胞分泌功能

传统观点认为, 干细胞通过细胞分化作用进行组织再生, 近年来的研究[19]则发现, 干细胞更可能通过“ 旁分泌” 和“ 抗炎作用” 修复受损组织。当局部组织受到损伤时, MSC被激活并分泌多种细胞因子, 发挥抗凋亡、抗炎、抗瘢痕、促血管生成的作用, 形成有利于组织修复的局部微环境[20]。

SHED也具备强大的分泌功能, 从而形成利于组织再生或修复的微环境。在神经再生的研究[21, 22, 23]中, 这一功能体现地较为突出。如在周围神经受损处, SHED可分泌神经生长因子（neuron growth factor, NGF）、脑源性神经营养因子（brain derived neuo-trophic factor, BDNF）、神经营养因子-3（neuro-trophin-3, NT-3）、 睫状神经营养因子（ciliary neu-rotrophic factor, CNTF）、神经胶质细胞源性的神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）等多种神经营养因子, 支持神经干细胞增殖、迁移、存活及轴突延长; 表达VEGF促进血管再生; 分泌细胞外基质的有效成分, 如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白及Ⅳ 型胶原以促进细胞黏附与增殖, 从而促进神经受损处轴突的生长[21]。

干细胞强大的分泌功能催生出无细胞疗法（cell-free therapy）的理念, 即不移植干细胞而利用干细胞的分泌物如SHED的条件培养物（SHED conditioned medium, SHED-CM）进行治疗[23, 24]。相对于干细胞移植而言, 细胞分泌物可以避免致瘤、免疫排斥和伦理争议问题。研究[25]发现, SHED产生的外泌体（exosomes）可抑制6-羟基多巴胺介导的神经元凋亡, 起到神经保护作用。

2.3 免疫调节功能

MSC具有免疫调节功能, 具体机制比较复杂。MSC可抑制T细胞, 抑制树突状细胞的成熟, 减少B细胞激活与增殖, 抑制自然杀伤细胞的增殖和细胞毒性, 通过IL-10途径促进Treg的产生, 从而对适应性免疫系统和固有免疫系统产生作用。MSC可形成促炎性MSC1型细胞（应激于组织急性损伤）或免疫抑制性MSC2细胞（抗炎、促进愈合）, 类似单核/巨噬细胞M1/M2型细胞之间的转换[26]。MSC可以加强宿主自身的免疫防御作用[27]。研究[28]表明, 人和猴的MSC主要通过2, 3-双加氧酶途径发挥免疫抑制作用。

如前所述, SHED具备免疫调节功能上的优势。SHED-CM可使小胶质细胞或巨噬细胞的表型由促炎性M1型转变成抗炎性M2型, 抑制CD4+T细胞增殖及其促炎症细胞因子的释放, 且其治疗作用与SHED-CM的成分唾液酸结合Ig样凝集素9的胞外域（ectodo-main of sialic acid-binding Ig-like lectin-9, ED-Siglec-9）有关[24]。除了免疫系统疾病, SHED的免疫调节功能也可用于其他系统疾病的治疗。

SHED可同时发挥细胞定向分化、细胞分泌和免疫调节等综合作用。SHED在治疗帕金森小鼠时, 可诱导分化为多巴胺能神经元, 同时也分泌神经营养因子发挥旁分泌作用[14]。

3 SHED在各器官系统疾病治疗中的应用

3.1 牙髓— 牙本质再生

临床上常见牙髓炎、根尖病变或外伤等原因使得年轻恒牙的牙根继续发育受阻, 寿命减损。牙髓再生旨在通过DPSC分化为成牙本质细胞和血管内皮细胞, 形成新生牙本质、血管及神经, 促进牙髓活力恢复及牙根的继续发育, 是治疗年轻恒牙牙髓病变的新思路。

近年来, 学者们广泛研究了SHED、根尖周牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla, SCAP）和DPSC在牙本质— 牙髓组织工程再生中的作用。在体内, SHED不仅可存活、增殖并形成牙本质样结构[1], 还可分化为成牙本质细胞样细胞和内皮样细胞并形成含血管网的似生理性牙髓样结构[29]。研究[17]证实, SHED可分化为成牙本质细胞和血管内皮细胞, 前者可分泌牙本质涎磷蛋白与牙本质基质蛋白1, 并形成管状牙本质, 后者可形成和宿主脉管相连的功能性血管。在组织工程牙髓再生的研究[30]中, 将SHED和生物支架（Puramatrix™ 或 rhCollagen type Ⅰ ）置入全长根管后移植到裸鼠背部皮下, 发现SHED可分化成具有分泌功能的成牙本质细胞, 并形成和正常牙髓的细胞、血管组分类似的功能性牙髓和管状牙本质。这些都是异位牙髓再生的研究, 目前还需要进一步探索SHED在口腔环境中介导牙髓— 牙本质再生的能力。

3.2 颌骨再生

口腔颌面外科诊疗中, 常见因外伤、肿瘤、炎症、先天发育畸形、牙周疾病等导致颌骨缺损的情况, 需要进行口颌面骨再生。利用干细胞的成骨能力, 进行组织工程骨再生是修复颌骨缺损的新策略。SHED与颌面骨、颅骨皆起源于神经嵴, 对于颌面骨、颅骨缺损修复是一个合适的干细胞源。

和BMMSC类似, SHED具有良好的成骨能力[1]。将犬的SHED与富血小板血浆的混合物植入犬下颌骨缺损处, 可形成与DPSC、BMMSC植入相似的血管化成熟骨组织[31]。研究[32]发现, SHED-CM在体外可促进种植体表面磷酸钙盐和胞外基质蛋白的沉积, 进而促进骨髓基质细胞的黏附; 在体内可刺激种植体周围新骨形成。Jahanbin等[33]研究表明, 将成骨诱导分化后的SHED和支架胶原蛋白基质一起植入到鼠的上颌牙槽骨缺损处, 可介导新骨形成, 治疗效果和自体髂骨移植类似。

3.3 神经系统疾病治疗

神经系统的再生修复能力有限, 对于神经系统疾病如脑卒中、外伤、退行性病变、肿瘤、炎症等, 药物、手术等治疗方式不能从根本上解决受损神经系统的结构与功能重建问题, 干细胞疗法是十分有希望的治疗方式。与神经系统有共同胚胎发育起源的牙源性干细胞SHED成为研究热点。

SHED有望用于中枢神经系统病变的治疗。将SHED和SHED诱导后形成的神经球定位注射到帕金森病大鼠模型纹状体, 发现两者皆可在大鼠模型的脑内存活, 并改善其行为障碍[14]。将未分化SHED或经诱导神经分化的SHED（induced SHED, iSHED）植入脊髓挫伤鼠的脊髓损害处, 可促进其运动功能的恢复, 且iSHED组较SHED组的运动功能改善更明显[22]。局部注射SHED可改善完全横断性脊髓损伤鼠的后肢运动功能, 效果和DPSC移植组类似, 且优于BMMSC和成纤维细胞移植组[11]。通过鼻腔给药将SHED-CM用于中动脉闭塞大鼠的治疗, 可见内源性神经前体细胞向组织损伤区的迁移与分化, 恢复运动功能并减轻缺血性脑损伤的面积[23]。

此外, SHED也可用于周围神经系统病变的治疗。SHED-CM局部用于鼠坐骨神经离断处, 可增加轴突密度和有髓鞘神经纤维的数量, 促进坐骨神经功能恢复, 减少肌肉萎缩[21]。

3.4 免疫系统疾病治疗

MSC具有低免疫原性和免疫调节功能, 在抗自身免疫反应、抗炎和肿瘤治疗等领域有广泛应用的潜能。SHED具有良好的免疫调节功能, 已成为免疫治疗的新热点。

给SLE小鼠静脉注射SHED, 可以改善小鼠的SLE紊乱症, 如降低自身抗体水平, 改善肾脏功能指标[8]。将冻存牙髓中分离的SHED进行体内实验也得到类似结果[34]。用SHED-CM治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎鼠, 可见鼠的疾病症状明显改善, 脊髓中神经脱髓鞘和轴突损伤减轻, 炎症性细胞浸润和促炎细胞因子分泌减少[24]。

3.5 其他方面

SHED用于其他系统疾病的治疗研究仅有少数报道。SHED可重建兔眼角膜缺损处的角膜上皮表面, 改善角膜透明度[35, 36]; 还可促进创口愈合[37, 38]。在鼠纤维化肝脏中, SHED可替代受损肝细胞, 发挥抗纤维化、抗炎作用, 促进肝功能的恢复[39]。SHED可以逆转糖尿病属的疾病症状, 并促进鼠正常血糖含量的恢复[40]。还有研究显示, SHED可促进急性肺损伤鼠的组织修复[41], 减轻急性肾损伤鼠的炎症[42]。

综上所述, SHED取自将自然替换的乳牙牙髓, 来源易得无创, 便于建立干细胞库, 较少涉及伦理争议, 在机体中可发挥定向分化、细胞分泌功能、免疫调节等多方面功能作用, 是十分理想的干细胞来源。

作者：李晓霞, 方滕姣子, 余湜, 赵玉鸣, 葛立宏.